De controle van de Gezondheid van Stevige Organen na Overplanting die DNA Zonder cellen gebruiken

De diagnostiek die op cfDNA wordt gebaseerd kon weefselbiopsie verouderd maken
De dure en invasieve weefselbiopsieën om allograft verwerping na overplanting te ontdekken hebben talrijke beperkingen. Analyses die op DNA zonder cellen worden gebaseerd (cfDNA) — de doorgevende fragmenten van DNA die van cellen, weefsels, en organen worden vrijgegeven zijn aangezien zij natuurlijke cel ondergaan dood-intensief bestudeerd onlangs en gekund onze capaciteit uiteindelijk verbeteren om verwerping te ontdekken, uitvoeren vroegere veranderingen in beheer, en verbeteren zelfs de overleving op lange termijn van overgeplante organen.
De CfDNAanalyses die de behoefte aan geheel-genoom rangschikkend (WGS) en de behoefte aan a priori kennis van donor en/of begunstigde genotypen omringen hebben krachtige logistieke voordelen en zijn momenteel onder klinisch nauwkeurig onderzoek. Bovendien heeft het verbeteren van kennis van de orgaan-specifieke kinetica van donor-afgeleid cfDNA (dd -dd-cfDNA) na overplanting ook helpen deze analyses optimaliseren. De laboratoria hebben ook alternatieve methodes geïntroduceerd om dd -dd-cfDNA, zoals de digitale kettingreactie (PCR) van de druppeltjepolymerase en orgaan-specifieke DNA-methylation patronen te kwantificeren. Als dusdanig, is het gebied van minimaal invasieve diagnostiek die op cfDNA wordt gebaseerd meer en meer belovend, één dag die potentieel traditionele weefselbiopsieën vervangen.
DE ROL VAN CFDNA IN ORGAANverwerping
Verwerping, die de naar verwonding van een geschonken orgaan verwijzen dat door het immuunsysteem van de ontvanger wordt veroorzaakt, kan allograft dysfunctie en zelfs geduldige dood veroorzaken. T-cell bemiddelde scherpe cellulaire verwerping (ACR) komt het vaakst binnen de eerste 6 maanden post-transplantatie voor (1). ACR impliceert accumulatie van de t-Cellen van CD4+ en CD8+-in de tussenliggende ruimte van allograft aangezien het immuunsysteem van de ontvanger antigenen op het geschonken orgaan buitenlands erkent. Deze t-Cellen stellen een immune cascade in werking die uiteindelijk tot geprogrammeerde celdood (apoptosis) van de gerichte cellen leidt. Aangezien deze cellen sterven, wordt genomic DNA gespleten en fragmenten die van dd -dd-cfDNA, ongeveer 140 basisparen (bp) in lengte de meten, worden vrijgegeven om zich bij de pool van ontvanger cfDNA in het bloed aan te sluiten en in urine (2) uiteindelijk afgescheiden.
Het doorgeven is cfDNA onlangs leveraged als kenmerkend hulpmiddel geweest om invasieve biopsieën op ander gebied van geneeskunde te vervangen, met inbegrip van het analyseren van foetale DNA-fragmenten binnen de moederomloop om genetische abnormaliteiten in utero te identificeren en het rangschikken van doorgevende DNA die van tumorcellen wordt vrijgegeven op kanker betrekking hebbende veranderingen te identificeren. In zowel deze gevallen evenals in overplanting, maakt de hoog-productie die die identificeert als DNA-opeenvolgingsverschillen rangschikken kwantificeert tussen de twee verschillende bevolking van cfDNA onderscheid die uit verschillende bronnen (2) wordt afgeleid. Drie kenmerken van cfDNA maken tot het een uitstekende niet-invasieve kandidaat biomarker om verwerping na stevige orgaanoverplanting te ontdekken: Het kan uit een eenvoudig bloed worden verkregen trekt, zijn nauwkeurig gemeten concentratie, en zijn gemakkelijk geïdentificeerde nucleotideopeenvolging. Gebruiken cfDNA als biomarker voor ACR is ook voordelig aangezien het zou moeten wordt afgeleid uit de verwonde cellen van het geschonken orgaan en daarom een directe maatregel van celdood vertegenwoordigen die in allograft voorkomen. Voorts cfDNA handhaaft alle genetische eigenschappen die van originele genomic DNA, het genetische materiaal toelaten dat van het geschonken orgaan wordt vrijgegeven om van cfDNA worden onderscheiden die uit cellen van de ontvanger wordt afgeleid die natuurlijke apoptosis (3) ondergaan.
Het frequente en nauwkeurige toezicht op allograft gezondheid is essentieel voor overleving de op lange termijn van transplantatieontvangers. Voor hartoverplanting (HT), is de endomyocardial biopsie (EMB) de huidige goudstandaard voor het ontdekken van ACR (4). Nochtans, is EMBs duur met significante beperkingen, veel waarvan voor alle orgaanbiopsieën (5-7) gemeenschappelijk zijn. Voorts zet de invasieve aard van EMBs HT patiënten op risico voor complicaties (6,8,9).
Jammer genoeg, hebben de nu verkrijgbare niet-invasieve methodes met inbegrip van echocardiografie of magnetic resonance imaging (MRI) voldoende specificiteit en gevoeligheid niet om verwerping (10-13) betrouwbaar te ontdekken. Op bloed-gebaseerde biomarkers, zoals cfDNA, vertegenwoordigen een veelbelovend alternatief dat gemakkelijk in klinische praktijk (14-17) zou kunnen worden uitgevoerd.
KINETICA VAN CFDNA TIJDENS RUST EN VERWERPING
Aangezien cfDNA natuurlijk uit - voorkomend proces van apoptosis voortkomt, hebben alle individuen opspoorbare niveaus van cfDNA in hun bloed (18). Voor gezonde individuen, komt de meerderheid van het doorgeven cfDNA uit hematopoietic cellen die natuurlijke dood met betrekking tot cellulaire omzet hebben ondergaan. De niveaus van cfDNA schommelen om veelvoudige redenen met inbegrip van besmetting, chirurgie, trauma, of zelfs diepgaande oefening (2,19). Daarom vereist het ontwikkelen van een cfDNA-gebaseerde analyse om verwerping te ontdekken beoordelend de verwachte kinetica van versie dd -dd-cfDNA in de de omloop post-transplantatie van de ontvanger. Deze overweging is vooral belangrijk aangezien de versie van na verloop van tijd post-transplantatie dd -dd-cfDNA (20-22) orgaan-specifiek is.
Bijvoorbeeld, bij 1 dag post-HT is het gemiddelde niveau van dd -dd-cfDNA 3,8 ± 2,3% (20). Nochtans, tegen 7 dagen is het niveau van dd -dd-cfDNA snel gedaald en constant laag gebleven (<1> in tegenstelling, werden de ontvangers tweezijdige longtransplantaties gevonden om een gemiddelde fractie dd -dd-cfDNA van 26 ± 14% op de eerste postoperatieve dag te hebben. Voorts werd de vermindering van dd -dd-cfDNA gekenmerkt door niveaus van dd -dd-cfDNA die daalden snel binnen de eerste week maar anderzijds vertraagden en over het algemeen op 1%-3% (21) onveranderd bleven. Nochtans, gelijkaardig aan hart en niertransplantaties tijdens een episode van scherpe verwerping, beduidend steeg het niveau van dd -dd-cfDNA, beklimmend tot een gemiddelde van 14%-15%.
De verschillen in weefselmassa en tarieven van cellulaire omzet geven van deze veranderlijkheid in de niveaus van dd -dd-cfDNA vrijgegeven vroege post-transplantatie en tijdens rust rekenschap. Bijvoorbeeld, kunnen de verschillen in het doorgeven van niveaus dd -dd-cfDNA in rustige tweezijdige en enig-longtransplantaties door het verschil in cellulaire omzet worden verklaard, die 107 versus 58 cellen/seconde, respectievelijk (21) zijn. Door contrast, in een rustig overgeplant hart, is het cellulaire omzettarief slechts 8 cellen/tweede (21-23). Aldus, is een inzicht in de verwachte niveaus van dd -dd-cfDNA verbonden aan een bepaald stevig orgaan essentieel om ontwikkeling van orgaan-specifieke analyses te vergemakkelijken die verwerping ontdekken. Zodra de kinetica van cfDNAversie voor een bepaald orgaan wordt begrepen, bestaan verscheidene methodes voor het kwantificeren van de relatieve hoeveelheid dd -dd-cfDNA.
STRATEGIEËN OM ONTVANGER VERSUS DONOR-AFGELEIDE CFDNA TE ONDERSCHEIDEN
Donor-ontvankelijke geslacht-Wanverhouding
Voor orgaantransplantaties waarin de donor mannelijk is en de ontvanger vrouwelijk is, kunnen de laboratoria hefboomwerking deze geslachtswanverhouding niveaus dd -dd-cfDNA van binnen de totale cfDNApool van de ontvanger berekenen (17). De onderzoekers toonden eerst de haalbaarheid van deze benadering in urinesteekproeven die uit vrouwelijke niertransplantatieontvangers worden genomen aan die een nier van mannelijke donors hadden ontvangen en toen zij ervoeren toonde de verwerping opgeheven niveaus van dd -dd-cfDNA in hun urine aan die specifiek gebieden bevatte die op het y-chromosoom (17) worden gevonden. Hoewel deze benadering voor zekere diagnose van verwerping in allograft toestaat, is de geslacht-wanverhouding tussen de donor en de ontvanger vrij zeldzaam en niet universeel toepasselijk.
Donor-ontvankelijke DNA-Opeenvolgingsverschillen
Een orgaantransplantatie kan ook als genoomtransplantatie worden beschouwd, aangezien de cellen binnen een overgeplant orgaan de genetische informatie van zijn donor bevatten. Als dusdanig, baseert het concept zich de dynamica (GTD) van de genoomtransplantatie op de aanwezigheid van genetische verschillen tussen de donor en de ontvanger bij een bepaalde plaats, die dan kan zijn leveraged om de oorsprong te identificeren van het doorgeven cfDNA (20-24). Ideaal gezien, zou de ontvanger voor één enkele basis (bijvoorbeeld, aa) homozygous zijn en bij dezelfde plaats zou de donor voor een verschillende basis (bijvoorbeeld, GG) homozygous zijn.
Gezien de genetische ongelijksoortigheid tussen individuen, kunnen de tientallen duizenden potentieel informatieve plaatsen over het genoom worden ondervraagd gebruikend hoog-productie rangschikkend om dd -dd-cfDNA van ontvanger te onderscheiden cfDNA (20,24). Dit concept was eerst geïllustreerd gebruikend belegde steekproeven van hartdonors om a priori donorgenotypen te verkrijgen voor elke hetontvankelijke in paren rangschikken. Na het halen en het rangschikken cfDNA van elke ontvanger, werd de fractie donor-specifieke molecules bepaald. In steekproeven worden genomen die tijdens of onmiddellijk voorafgaand een biopsie-bewezen verwerpingsgebeurtenis, werd het aandeel donor-specifiek enig nucleotidepolymorfisme (SNPs) gevonden om van 3%-4% <1>(24) gestegen te zijn.
Deze vroege retrospectieve studie is nu voor de toekomst bevestigd. De volwassen en pediatrische hart en longtransplantatieontvangers werden aangeworven en de genotypen voor elk donor-ontvankelijk paar werden verkregen door WGS met een geïdentificeerd gemiddelde van 53.423 informatieve SNP-tellers (20). De algemene, vroege opsporing van scherpe verwerping was superieur aan dat van AlloMap, het eerste Voedsel en de Drug beleid-Goedgekeurde niet-invasieve benadering van ontdekken van ACR na HT gebaseerd bij de transcriptomeanalyse (25).
Het onderzoek heeft ook aangetoond dat WGS niet alleen informatie over een ent maar ook patiënt virome en algemene staat van immunosuppression verstrekt. Dit vertegenwoordigt een potentieel groot voordeel onverkrijgbaar door andere analyses (26-28).
Nochtans, staat WGS voor uitdagingen die het uit routine in klinische praktijk konden verhinderen worden uitgevoerd. Bijvoorbeeld, terwijl de genetische informatie van een ontvanger gemakkelijk kan worden verkregen, is dit niet altijd waar voor een donor. Voorts is WGS duur, intensief, en tijdrovende arbeid -.
Een alternatieve methode stelt een paneel van tewerk genotyped veelvormige SNPs die binnen de pool van gehaald wordt geïdentificeerd cfDNA daardoor eliminerend de behoefte aan a priori kennis van het donor-specifieke genotype (29). In tegenstelling tot nier en levertransplantaties, die vaak tussen nauw verwante individuen voorkomen, zijn de donor-ontvanger paren voor hart en longtransplantaties typisch niet verwant. GTD vereist het genotyping van zowel de transplantatieontvanger als donor. Nochtans, in de praktijk, is de informatie van het donorgenotype vaak niet beschikbaar. Hier, behandelen wij deze kwestie door een algoritme te ontwikkelen dat niveaus dd -dd-cfDNA bij gebrek aan een donorgenotype schat. Ons algoritme voorspelt hart en longallograft verwerping met een nauwkeurigheid die aan conventionele GTD gelijkaardig is. Wij raffineerden verder het algoritme om nauw verwante ontvangers en donors, een scenario te behandelen dat in beendermerg en nieroverplanting gemeenschappelijk is. Wij tonen aan dat het mogelijk is om dd -dd-cfDNA in de patiënten van de beendermergtransplantatie te schatten die niet verwant zijn of die siblings van de donors zijn, gebruikend een verborgen Markov model. Daarom zijn de algoritmen ontwikkeld voor hart en longtransplantaties die veronderstellen dat het genotype van de donor bij dezelfde frequentie zoals de algemene bevolking voorkomt. Gebaseerd op deze frequenties en vergelijking aan het bekende genotype van de ontvanger, kan de fractie van dd -dd-cfDNA betrouwbaar vanaf de totale pool van cfDNA worden geschat die van de het plasmasteekproef van een ontvanger wordt geïsoleerd.
In het geval van longoverplanting, werd dit enig-genoommodel, wanneer vergeleken bij de methodologie die zowel donor als begunstigde genotypen gebruiken, gevonden om vergelijkbare fracties van dd -dd-cfDNA te verstrekken. Nochtans, toen de onderzoekers dit zelfde algoritme op HT toepasten, waren de geschatte niveaus van dd -dd-cfDNA niet zo sterk gecorreleerd zoals in longtransplantaties. Dit zou op de lagere absolute hoeveelheden dd -dd-cfDNA kunnen worden betrekking gehad huidig na HT. Dit is een ander voorbeeld van orgaan-specifieke cfDNAkinetica die analyseresultaten kan beïnvloeden en moet worden in acht genomen (30).
In het geval van nieroverplanting, zijn de prospectieve studies uitgevoerd om het geïdentificeerde nut van niveaus na te gaan dd -dd-cfDNA, gebruikend bekende donor-specifieke SNPs, als haalbare teller voor verwerping. In één dergelijke studie, werden 384 nierontvangers aangeworven van 14 klinische plaatsen om bloedmonsters met geplande intervallen en op momenten van klinisch vermelde biopsieën (31) te verstrekken. Globaal, concentreerde de studie zich op de correlatie tussen de histologie in 107 biopsiespecimens van 102 patiënten en de niveaus van dd -dd-cfDNA die in aangepaste plasmasteekproeven worden gevonden. Specifieker, werden 27 biopsiesteekproeven van 27 patiënten met actieve verwerping verkregen samen met 80 biopsiesteekproeven uit 75 patiënten zonder actieve verwerping.
In deze studie, omvatte de actieve verwerping scherpe antilichaam-bemiddelde verwerping (AMR), chronische AMR, en ACR. De analyse die in deze studie wordt gebruikt wendde een 1%-scheiding voor de fractie van dd -dd-cfDNA aan om op de aanwezigheid of het ontbreken van actieve verwerping te wijzen en werd gevonden om 85%-specificiteit (95% ci, 79%-91%) en 59%-gevoeligheid (95% ci, 44%-74%) te hebben. De gevoeligheid van deze analyse was groter voor het onderscheiden tussen actieve en afwezige AMR, aangezien het gebruik van een scheiding van 1% dd -dd-cfDNA werd gevonden om een 83%-specificiteit (95% ci, 78%-89%) en 81%-gevoeligheid (95% ci, 67%-100%) te hebben. In het bijzonder, in beide gevallen, wezenlijk daalde de gevoeligheid toen de fractie van dd -dd-cfDNA 3% overschreed.
Om specificiteit en gevoeligheid van een niet-invasieve cfDNA-gebaseerde analyse te verbeteren om verwerping na nieroverplanting te ontdekken, hebben de onderzoekers ook de absolute hoeveelheid dd -dd-cfDNA (32-33) onderzocht. Door de absolute hoeveelheid dd -dd-cfDNA te ondervragen, kan men de kunstmatige veranderingen in de fractie van dd -dd-cfDNA elimineren toe te schrijven aan verhogingen van totale cfDNAniveaus die door niet-verwerpingsgebeurtenissen worden veroorzaakt, zoals besmetting, trauma, of oefening, potentieel creërend een nauwkeurigere analyse.
Om deze mogelijkheid te onderzoeken, wendde één studie 32 informatieve varianten (CNVs) van het exemplaaraantal dat op bevolkingsfrequenties, in tegenstelling tot relatieve aandelen van donor en begunstigde SNPs bij bepaalde plaatsen (32) wordt gebaseerd aan. Al CNVs niet huidig binnen het genoom van een ontvanger maar heden binnen gehaald werd cfDNA daarom verondersteld om dd -dd-cfDNA te vertegenwoordigen.
Interessant, terwijl de specificiteit en de gevoeligheid globaal met het gebruik van absolute niveaus dd -dd-cfDNA verbeterden, had deze analyse ook een grotere capaciteit om tussen de aanwezigheid en de afwezigheid van actieve AMR, in tegenstelling tot gevallen van actieve ACR onderscheid te maken. Bovendien volstonden de niveaus van de serumcreatinine niet in het onderscheiden tussen actieve verwerping en rust, die waarschijnlijk omdat het meer indicatief is van kluwenvormige functie in tegenstelling tot de schade van het nierweefsel (31-33).
Een andere studie onderzocht de absolute niveaus van dd -dd-cfDNA in de ontvangers van de niertransplantatie met betrekking tot niveaus van tacrolimus, immunosuppressant (33). Hier, vonden de onderzoekers dat de absolute hoeveelheid dd -dd-cfDNA wezenlijk hoger was in patiënten met lagere tacrolimusniveaus (<8> de Laboratoria hebben ook alternatieven aan WGS voorgesteld. Onze onderzochte groep richtte het rangschikken van 124 hoogst veelvormige (minder belangrijke allele frequentie [MAF] >0.4) SNPs gebruikend een in de handel verkrijgbaar paneel, volgende-generatie rangschikkend, en een nieuw algoritme (34). Deze benadering verminderde beduidend de totale hoeveelheid het rangschikken van vereiste, dalende kosten en analysetijd, en het toelaten van snelle analyse. Nochtans, aangezien deze analyse op verschillen in MAF tussen individuen vertrouwt, zou het niet voor nauw verwante donor-ontvankelijke paren robuust zijn, zoals gezien in op leven betrekking hebbende nierschenking. Het moet nog voor het ontdekken van gematigde of grotere verwerpingsgebeurtenissen worden bevestigd.
De laboratoria hebben ook gebruikend veelvormige SNPs om dd -dd-cfDNA te kwantificeren die met de technologie van digitale druppeltjepcr (30,35-37) onderzocht wordt gecombineerd. Gebruikend 41 hoogst veelvormige SNPs, toonden de stabiele nier en HT de ontvangers fracties dd -dd-cfDNA van 2%-3% met de stabiele ontvangers die van de levertransplantatie een niveau van 7% (35) hebben.
CONCLUSIES
Het gebruik van een dure en invasieve weefselbiopsie om allograft verwerping te ontdekken heeft significante beperkingen. Als dusdanig, een minimaal invasieve analyse die de gezondheid van het volledige overgeplante orgaan kan direct en nauwkeurig beoordelen vertegenwoordigt heilige grail in stevige orgaanoverplanting.
Het gebruik van cfDNA na overplanting heeft één of andere aanvankelijke belofte getoond, maar de verdere studie en de bevestiging worden vereist om ons begrip van zowel de basisbiologie van cfDNA evenals zijn gedrags post-transplantatie te verbeteren. Op dit ogenblik, is het duidelijk dat er belangrijke orgaan-specifieke verschillen bestaan, en de patronen van cfDNAversie kunnen ook afhankelijk van het type van verwerpingsgebeurtenis verschillen. Nochtans, cfDNA vertegenwoordigt één van de veelbelovendste technologieën die nog worden ontwikkeld om uiteindelijk de weefselbiopsie aan te vullen of te vervangen.